Флора Национального парка разнообразна и включает не менее 440 видов высших сосудистых растений, список мохообразных — более 60 видов. В составе древостоя — дуб черешчатый, липа сердцевидная, клёны остролистный, равнинный и татарский, ясень обыкновенный, вязы шершавый и гладкий. В подлеске — орешник, крушина, жостер, бересклеты бородавчатый и европейский, жимолость лесная. В травяном покрове доминируют пролесник многолетний, копытень европейский, осока волосистая, пиретрум щитковый, чемерица чёрная, лилия саранка, серпуха красильная, бубенчик лилиелистный.

На склонах балок и речных долин широко распространены сообщества луговых степей с доминированием ковыля перистого и шалфея лугового. В составе степных сообществ встречается целый ряд редких и охраняемых видов — адонис весенний, венечник ветвистый, володушка серповидная, истод сибирский, качим высочайший, ковыль волосатик, коровяк фиолетовый, лук желтеющий, овсец Шелля. На каменистых обнажениях встречаются лук желтеющий, солнцецвет монетчатый и оносма простейшая.

Растительный покров болот (комплекс из 38 болот различных типов) весьма разнообразен: клюква болотная, болотный мирт, пушица влагалищная, шейхцерия болотная, очеретник белый и другие виды, а также разнообразные сфагновые мхи — сфагнумы боже иственный, болотный, папиллозный, обманчивый, узколистный, береговой, оттопыренный.

На территории Национального парка выявлено 190 видов грибов, образующих крупные плодовые тела и знакомых любителям «тихой охоты» как шляпочные грибы.

Перечень представителей фауны включает в себя не менее 960 видов животных. Среди них 39 видов млекопитающих, 172 — птиц, 8 — пресмыкающихся, 10 — земноводных, не менее 20 — моллюсков, не менее 30 — паукообразных, более 686 — насекомых.

Фауна млекопитающих типична для средней полосы европейской России. Насекомоядные представлены южным ежом, обитающим вблизи населенных пунктов и, распространенным повсеместно, обыкновенным кротом, обыкновенной бурозубкой и малой белозубкой. Из девяти видов хищников, обитающих в Национальном парке, по численности лидирует лисица. Копытные представлены кабаном, лосем и косулей.

На различных участках леса можно встретить зяблика, славку черноголовку, пеночку трещотку, черного и певчего дроздов, зарянку, мухоловок пеструшку и белошейку, синиц большую и лазоревку, обыкновенного поползня и других.

Самые многочисленные представители пресмыкающихся — уж обыкновенный, ящерицы живородящая и прыткая. Также на территории Национального парка обитают веретеница, обыкновенная гадюка, встречается медянка обыкновенная.

В Национальном парке обитает порядка 200 редких представителей флоры и 24 представителей фауны, занесенных в Красные книги различного уровня.

В Национальном парке «Тульские засеки» находятся уникальные геологические объекты. Это урочище «Ведьмина гора» («Красная гора») — редкая форма рельефа: крутой и высокий склон, интенсивно изрезанный короткими глубокими оврагами, в бортах которых имеется серия разрозненных четвертичных, мезозойских и верхнедевонских обнажений; Конь-камень — группа глыб кварцевого песчаника, самая крупная из которых достигает в поперечнике более 5 метров и весит около 20 тонн; Вязовские буилы — крупное скопление русловых камней, относящееся к категории крайне редких пойменных ландшафтов. Несколько десятков крупных глыб песчаника сопровождают здесь правый берег реки Красивая Меча на протяжении 50 м; Шиловский бугор — известняковый останец выраженной конусовидной формы, возвышающийся над руслом реки на высоту до 15 — 20 м; Каменная дорога — горизонтальное обнажение породы, имеющее вид узкой цокольной терраски, находящейся на высоте 4 м над урезом реки Красивая Меча; утёс «Галочник» — крупный скальный выход карбонатных пород. Обнажение образует три почти отвесные стенки высотой до 21 м.